hari apa ini? tanggal berapa? jam brapa?
T_T
gw udah remove fb nya...
plisss jgn berpikiran karena gw benci dia ga memiliki perasaan yg sama dg gw, bukaaan! bukan sama sekali karena itu!!!
hanya saja mgkn inilah mmg saatnya gw harus pergi sejauh2nya dari dia, dari semua ttg dia..
jujur lagi2 ini gak gampang, air mata gw gak berenti ngalir sampe detik ini, sebenernya jg gamau sampe kaya gini bgt, harus pula remove fbnya, gw gatau, beneran sumpah gw gatatu lg harus gimana!!!!! T_T :'(
sudahlah kenapa air mata ini gak berenti2nya ngalir, sudahlah moniq!!!!!!!!!!!!!!!
sudahlaaaaaaah, apa sih yg lo tangisin!!! T_T
maaaaaap i, maaaaappp T_T
karena gw rasa gw ga kan pernah bisa menjauh sdgkan tiap hari gw ngikutin aktipitasnya, bahkan pagi2 udahlah bangun telat, bener2 udah telat masih aja sempetin buka fb nya dia, gila aja gw, emg udah gila!!!!
maaaaap i, bukan bermaksud memutus hubungan silaturahmi, tapi aku emg harus pergi, bukan salah i, i gak salah apa2, i juga gak perlu mikirin perasaan aku, dan jujur emang tadi itu berawal dari aku ngepost youtube utopia lelah
"penantian yg panjang seperti tak kan berakhir, ku tlah sampai di ujung batas kesabaran ini
aku lelah, aku sungguh lelah,
adakah sang malam mengasihiku, kan kupeluk dia dg segala cemasku..
saatnya tlah dtg untuk meninggalkanmu
aku kan pergi menjauh untuk selama2nya...."
aku tau kamu lagi online, tapi kenapa kamu harus bkin status "semoga berakhir indah"
aku emg ga minta kamu ngertiin perasaan aku i, hanya saja aku mmg sedih bacanya, apalagi komen2nya, komen itu, aku udah ngerasa dr dulu kamu suka sama kak s** ..
aku bikin wall ke anday emot sedih doang, aku tau kamu baca wall itu dan kamu hapus status kamu itu, aku ga minta i kamu ngertiin perasaan aku, gak i, aku hanya sedih, ini perasaan aku, ini masalah aku sendiri, gausa kamu sampe kebawa2 dan selanjutnya ngerasa ga bebas bikin satatus lagi, silahkan i, sekarang kamu udah bebas T_T
maaappppppppp.
hapus air mata lo niq, lupakan semua, lanjutin hidup lo!!!
Bismillah..
besok pagi yang baru.......................................
Kamis, 14 Juli 2011
simpan disini dolo
DETEKSI GEN SITOKROM-B BABI SEBAGAI PENANDA MOLEKULER UNTUK MEMERIKSA PEMALSUAN DAGING SAPI DAN PENCEMARAN PRODUK OLAHANNYA DENGAN METODA REAL-TIME PCR
Nama : ENNISA SONIA
No. BP : 07131026
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Pemberian label halal pada makanan sangat penting untuk menjamin keamanan produk makanan dan menjaga kepercayaan konsumen (Tanabe, et al., 2007). Itulah sebabnya produk-produk bersertifikasi halal sangat didambakan dan dicari oleh konsumen pada umumnya, baik muslim maupun non-muslim (Majelis Ulama Indonesia, 2008).
Produk pangan yang tercemar oleh daging babi cukup meresahkan masyarakat di Indonesia. BPOM menemukan produk olahan dari daging sapi yang tercemar oleh daging babi seperti sosis, kornet, bakso, dan lain-lain. Seluruh makanan yang ditemukan ternyata bukan asli buatan Indonesia tetapi diimpor dari Malaysia, Singapura, Thailand, dan Jerman. Beberapa diantaranya tidak mencantumkan komposisi makanan dengan lengkap (Hikmal, 2009).
DNA mitokondria biasanya digunakan untuk menunjukkan perbedaan filogenik dari berbagai spesies. Pada babi, sitokrom-b dan bagian D-loop digunakan sebagai penanda genetik adanya hubungan antara keturunan babi yang berbeda. Mitokondria babi (mtDNA) merupakan 16 kb sirkular molekul dimana di dalamnya terdapat 13 protein-kode gen, 22 tRNA dan gen bertanggung jawab untuk 12S dan 16S rRNA. Sitokrom-B haplotipe dapat dengan mudah dideteksi dengan dasar empat nukleotida polimorphisme yang terletak di posisi 15036, 15038, 15041, dan 15045 bp pada rantai DNA lengkap dari mtDNA babi (Clop, et al., 2004).
Kemajuan dalam teknologi DNA telah membawa pada perkembangan yang cepat dalam pendekatan alternatif untuk identifikasi spesies. Penggunaan PCR dalam teknik analisis makanan telah meningkat karena metodenya yang lebih sederhana, spesifik dan sensitif. Polymerase Chain Reaction (PCR) ditemukan oleh Karry Mulis pada tahun 1980. PCR adalah suatu metode yang dapat melipatgandakan segmen DNA dalam tabung dengan bantuan enzim DNA polymerase. Prinsip kerja metode PCR yaitu mengubah rantai ganda DNA menjadi helaian tunggal, terbentuknya ikatan anatara primer dan terjadi pemanjangan DNA dengan bantuan enzim Taq Polymerase (Matsunaga, et al., 1999; Valasek & Joyce, 2005; Powledge, 2003; Vailleux, 2003).
Metode PCR kemudian mengalami pengembangan yang dinamakan Real-Time PCR, bahwa hasil amplifikasi dianalisis selama proses amplifikasi dengan menggunakan pewarna DNA atau pelacak berfluorosensi. Analisis data dilakukan dalam instrumen yang sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel, dan tanpa pemisahan dengan elektroforesis (Sudjadi, 2008). Real-Time PCR ini lebih tepat dalam pengukuran secara kuantitatif jumlah dari asam nukleat dibandingkan dengan PCR konvensional, karena pada Real-Time PCR amplifikasi asam nukleat terdeteksi pada fase eksponensial dimana lebih baik dibandingkan fase plateau pada PCR konvensional (Ahmad, et al., 2007).
Untuk itu metoda yang akan digunakan dalam penelitian ini dipilih metoda Real-Time Polymerase Chain Reaction. Kepekaan dari metoda ini ditentukan oleh pemilihan primer yang tepat. Dalam penelitian ini dipilih gen Sitokrom-B sebagai gen spesifik dari babi yang merupakan target utama untuk mendeteksi kandungan babi di dalam produk daging (Tanabe et al., 2007). Pada penelitian ini sendiri akan dilakukan deteksi pada beberapa sampel yang dicurigai mengandung unsur babi.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah ditemukan gen sitokrom-b babi pada daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket, dan abon sapi di kota Padang?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mendeteksi gen sitokrom-b babi pada daging sapi dan produk olahannya yang terdapat dipasaran
2. Memanfaatkan metoda Real-Time PCR
1.4 Manfaat Penelitian
1. Aplikasi molekular dengan Real-Time PCR
2. Mengetahui kehalalan produk makanan
3. PELAKSANAAN PENELITIAN
2.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan selama dua bulan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Andalas.
2.2 Metode Penelitian
2.2.1. Penyiapan alat dan bahan
2.2.2. Strilisasi Alat
2.2.3. Pengambilan Sampel
2.2.3. Isolasi DNA dari sampel
2.2.4. Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian DNA hasil isolasi dengan metode Elektroforesa
2.2.5. Deteksi Cytocrome b dengan metoda Real Time PCR
2.3 Alat dan Bahan
2.3.1 Alat
Mesin Real-Time PCR (LightCycler®), tabung eppendorf 1.5 ml, erlemeyer, gelas piala, gelas ukur, pipet mikro (eppendorf®), tip (10 µl, 200µl, 100µl), vortex (Mixer® VM-100), timbangan digital, sentrifugator (Thermo®), laminar air flow (ESCO®), autoklaf, inkubator (Thermo®), High Pure Filter tubes (Roche®), collection tubes (Roche®), lumpang, stamfer, perangkat elektroforesa, gel documentation system (Bio-Rad®), kertas parafilm.
2.3.2 Bahan
Sampel abon sapi, daging sapi pasar, daging sapi supermarket, bakso, kontrol positif (daging babi), kontrol negatif (aqua), daging sapi segar, High pure PCR Template Preparation Kit (Rosce®) (yang terdiri dari Tissue Llysis buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, wash buffer, elution buffer), LightCycler Master mix kit PCR (Roche®), PBS (Phospat Buffer saline ), agarose powder, ethidium bromida, Tris Boric acid EDTA (TBE),Isopropanol.
2.4 Cara Kerja
2.4.1 Sterilisasi Alat Dan Bahan
Alat-alat gelas dibungkus dengan kertas perkamen, pipet mikro ditaruh dalam wadahnya, ditutup rapat dan diberi selotip, eppendorf dimasukkam dalam gelas piala ditutup rapat dengan aluminium foil, lalu semua disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 15 lbs selama 15 menit.
2.4.2 Pengambilan Sampel
Sampel berupa daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket , dan abon sapi yang berdar di kota di kota Padang.
2.4.3 Isolasi DNA sampel
1. 20 mg sampel digiling dan tambahkan 100µl PBS (Phospat Buffer Saline) kemudian pindahkan ke dalam tabung ependorf.
2. Tambahkan 200µl Tissue lysis buffer kemudian homogenkan menggunakan vortex.
3. Tambahkan 40µl Proteinase K kemudian homogenkan menggunakan vortex.
4. Inkubasi sampel selama 24 jam pada suhu 70˚C.
5. Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 200µl Binding Buffer kemudian homogenkan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 70˚C.
6. Tambahkan 100µl isopropanol dingin kemudian sentrifus 8000xg selama 2 menit dan akan terpisah antara endapan dan supernatan.
7. Supernatan dipindahkan kedalam filter tube dimana di bagian bawah filter tube diletakan collection tube dan sentrifus 13000 xg selama 4 menit, dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
8. Endapan yang terdapat pada filter tube ditambahkan Inhibitor removal buffer 500µl, dan ganti colection tube sebelumnya dengan collection tube yang baru kemudian sentrifus 13000xg selama 2 menit, dimana endapan akan berada pada filter tube dan supernatan akan berada pada collection tube.
9. Ganti collection tube sebelumnya dengan collection tube yang baru dan pada filter tube ditambahkan Wash Buffer 500µl dan sentrifus 13000xg selama 2 menit, maka akan terpisah antara endapan dan supernatan, dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
10. Ganti collection tube sebelumnya dengan collection tube yang baru dan pada filter tube ditambahkan Wash Buffer 500µl dan sentrifus 13000xg selama 2 menit, maka akan terpisah antara endapan dan supernatan, dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
11. Ganti collection tube sebelumnya dengan tabung ependorf 1.5 ml dan pada filter tube ditambahkan ellution buffer 200µl yang telah diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70˚C kemudian sentrifus 13000xg selama 2 menit maka akan terpisah antara supernatan dan endapan dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
12. Supernatan yang terdapat pada tabung ependorf merupakan template DNA hasil isolasi.
2.4.4 Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian DNA hasil isolasi dengan metode Elektroforesa
Pembuatan Agarose 2% dengan cara 2 gram serbuk agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE di dalam erlemeyer, dipanaskan hingga terbentuk massa yang homogen, didihkan 1-2 menit, lalu dituangkan pada cetakan elektroforesa. 5µl Template DNA hasil isolasi dicampurkan dengan 1µl blue dye solution dan 5µl TE buffer diatas kertas parafilm, lau dimasukan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesa dilakukan menggunakan gel agarose 2 % dan menggunakan tegangan 75 volt selama 1 jam. Selanjutnya gel diwarnai dengan larutan ethidium bromida selama 15 menit, kemudian direndan dengan air selama 5 menit dan dilihat gambarnya dibawah alat pengamat DNA ( lampu UV). Gel tersebut difoto menggunakan Gel Documentation System. Pada foto dapat dilihat pemisahan pita DNA hasil isolasi.
2.4.4 Pengaturan Program Real Time PCR
Komponen-komponen dan campuran yang digunakan :
Pereaksi Jumlah Pereaksi (µl)
Aquadest Steril 8
Forward Primer 1,0
Reverse Primer 1,0
Probe 1,0
Taqman 4
Template DNA 5
Volume Total 20
Keterangan :
Forward Primer : 5’-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3’
Reverse Primer : 5’-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3’
Tiap-tiap komponen dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian ditambahkan genom DNA, dihomogenkan dan dimasukkan ke mesin Real-Time PCR yang telah dibuat program kerjanya.
Program mesin Real-Time PCR untuk gen sitokrom-b babi (45 siklus) :
Siklus Temperatur (°C) Waktu
1 95 10 menit
45 95
58
72 10 menit
40 menit
60 detik
1 40 7 menit
1 10 ∞
2.4.5 Analisi Data
Data berupa grafik hasil deteksi dengan metode Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) yang siap untuk dianalisis.
2.6 Jadwal Pelaksanaan
No
Kegiatan Bulan ke
1 2 3 4 5 6 7
1 Persiapan / Pelaksanaan Penelitian
2 Pengolahan data
3 Penulisan Skripsi/makalah seminar
4 Persiapan Seminar Hasil
5 Penyempurnaan Skripsi dan Persiapan Ujian Akhir
6 Ujian Akhir
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Hasil
Dari penelitian yang telah dilaksanakan diperoleh hasil sebagai berikut :
1. Didapatkan template DNA hasil isolasi dari sampel daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, dan daging sapi giling yang terdapat di supermarket dengan menggunakan metode elektroforesis. (Lampiran 5, Gambar 1).
2. Hasil deteksi gen sitokrom b babi pada semua template DNA sampel yang dianalisa dengan Real Time PCR menunjukkan hasil yang negatif. Ini dapat dilihat dari grafik yang dihasilkan, dimana grafik yang muncul hanya mendatar tidak berhimpitan dengan garis pada grafik kontrol positif dari daging babi segar. (Lampiran 6, Gambar 2).
3.2. Pembahasan
Identifikasi spesies jaringan dalam produk daging atau makanan olahan dapat dilakukan dalam berbagai metode. Beberapa metode yang sering dilakukan antara lain dengan metode elektroforesis, kromatografi dan teknik imunologi. Namun metode ini sering tidak cocok untuk produk makanan yang kompleks atau rumit, tidak sensitif untuk bahan-bahan yang telah diproses karena sulit untuk membedakan spesies yang berhubungan dan memakan waktu yang lama. (Kesmen, 2007).
Kemajuan dalam bidang teknologi membawa kita pada pengujian dengan metode yang lebih baik dan efektif untuk mendeteksi cemaran atau kontaminasi suatu campuran yang tidak diinginkan dalam suatu makanan olahan. Mergawati & Ridwan (2010) dalam penelitiannya menyebutkan bahwa biasanya pencampuran dengan bahan lain selain bahan aslinya dimaksudkan untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif lebih murah dibandingkan jika makanan olahan tersebut dibuat dari daging sapi murni. Salah satunya metode pendeteksian yang dilakukan yaitu dengan menggunakan metode yang efektif dan efisien yakni Real Time Polymerase Chain Reaction.
Real Time PCR merupakan pengembangan dari metode PCR, bahwa hasil amplifikasi dianalisis selama proses amplifikasi denagn menggunakan pewarna DNA atau pelacak berflurosensi. Analisi data dilakukan dalam instrument yang sama, tanpa pemindahan sampel, dan tanpa pemisahan dengan elektroforesis. Metode ini dapat digunakan untuk analisis secara kuantitatif jumlah DNA awal sehingga dapat digunakan untuk analisis pengukuran secara kuantitatif (Sudjadi, 2008).
Langkah pertama dalam pengerjaan penelitian ini adalah dengan melakukan isolasi DNA untuk mendapatkan template DNA. Dimana DNA hasil isolasi tersebut setelah itu diuji kemurniannya dengan metode elektroforesis dan kemudian akan dianalisa menggunakan Real Time PCR.
Isolasi DNA ini adalah upaya untuk membebaskan materi genetik (DNA) dari dinding sel dan ikatan protein dengan mengupayakan tingkat kerusakan baik mekanis maupun fisis seminimal mungkin terhadap materi genetik tersebut (Jamsari, 2010).
Isolasi DNA pertama kali dilakukan pada sampel daging babi segar. Template DNA yang didapat dari daging babi segar ini dijadikan sebagai kontrol positif. Metode isolasi DNA menggunakan produk commercial kit yaitu High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche®). Reagen High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche®) terdiri dari larutan Tissue Lysis Buffer, larutan Binding Buffer, Proteinase K, Larutan Inhibitor Removal Buffer, Larutan Wash Buffer, Larutan Elution Buffer (Lampiran 7, Gambar 3).
Larutan Tissue Lysis Buffer berfungsi dalam pemecahan jaringan secara mekanik untuk membebaskan sel-sel yang terdapat pada sampel. Larutan Binding Buffer berfungsi mempertahankan ph. Penambahan Proteinase K bertujuan mendegradasi protein-protein yang mengikat benang-benang DNA pada kromosom dan menginaktivasi enzim DNAse. Larutan Inhibitor Removal Buffer dan Larutan Wash Buffer berfungsi untuk pemurnian DNA, sedangkan larutan Elution Buffer bertujuan untuk melarutkan endapan DNA yang terdapat pada filter tube sehingga didapatkan template DNA hasil isolasi.
Kemudian selanjutnya dilakukan elektroforesis terhadap template DNA yang telah didapatkan tersebut. Teknik elektroforesis merupakan salah satu teknik pemisahan molekul dengan menggunakan arus listrik yang memanfaatkan prinsip perbedaan berat/besar molekul. Gel elektroforesis mempunyai pori-pori sehingga DNA mudah menyerap melewati lubang pori-pori dan selanjutnya berpindah ke muatan positif. Konsentrasi gel agarose akan menentukan besarnya pori-pori yang akan dilewati oleh molekul DNA. Semakin besar konsentrasi agarosa yang digunakan, berarti semakin kecil pori-pori yang akan dilalui, sehingga laju migrasi molekul DNA juga semakin lambat. Selain konsentrasi gel agarosa, beberapa fakor lain yang juga mempengaruhi hasil elektroforesa, yaitu jumlah molekul DNA, berat molekul dan kekuatan arus listrik yang digunakan (Jamsari, 2007).
Pembuatan Agarose 2% dengan cara 2 gram serbuk agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE di dalam erlemeyer, dipanaskan hingga terbentuk massa yang homogen, didihkan 1-2 menit, lalu dituangkan pada cetakan elektroforesa. 4µl Template DNA hasil isolasi dicampurkan dengan 1µl blue dye solution dan 6µlTE buffer diatas kertas parafilm, lau dimasukan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesa dilakukan menggunakan gel agarose 2 % dan menggunakan tegangan 75 volt selama 1 jam. Selanjutnya gel diwarnai dengan larutan ethidium bromida selama 15 menit, kemudian direndan dengan air selama 5 menit dan dilihat gambar dibawah alat pengamat DNA ( lampu UV). Gel tersebut difoto menggunakan Gel Documentation System. Pada foto dapat dilihat pemisahan pita DNA hasil isolasi.
Hasil isolasi DNA dan pengujian kemurniannya dengan elektroforesis pada daging babi segar memperlihatkan pola pita DNA, ini berarti template DNA yang didapatkan telah murni. Template DNA dari daging babi segar ini dijadikan sebagai kontrol positif. Sedangkan hasil elektroforesa pada sampel abon untuk pengujian pertama kalinya tidak didapati adanya penampakan pola pita DNA. Hal ini dapat terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain karena sampel abon sapi ini telah banyak bercampur dengan bahan lainnya serta juga bisa dikarenkan kandungan dagingnya yang sedikit. Selain itu zat warna yang terdapat pada sampel juga sangat mempengaruhi isolasi DNA-nya.
Pada percobaan yang kedua, dilakukan perendaman terlebih dahulu terhadap sampel abon sapi tersebut dengan tujuan mengurangi konsentrasi zat warna didalamnya. Kemudian setelah dilakukan elektroforesis kembali, hasil yang diperoleh hanya berupa smear yang artinya template DNA yang didapat masih belum murni.
Kemudian dilakukan kembali pengisolasian terhadap sampel, kali ini digunakan kit komersial lainnya yakni kit Promega. Perbedaan kit promega ini dengan kit Rosche yang telah dilakukan terlebih dahulu yaitu pada prinsip kerjanya. Dimana kerja kit rosche menggunakan prinsip penyaringan atau filter sehingga ada kemungkinan DNA tersangkut pada filternya. Sedangkan kit promega menggunakan prinsip pengendapan, dimana dengan kecepatan sentrifus yang besar DNA akan mengendap dibawah tabung eppendorf.
Namun isolasi yang dilakukan dengan kit promega ini masih memberikan pola pita DNA berupa smear. Hal ini menandakan DNA yang didapatkan masih belum murni. Oleh karena itu dilakukan perbandingan dengan menguji sampel lain berupa daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket dan daging sapi giling yang terdapat di supermarket. Dalam pengerjaan isolasi dari ketiga sampel baru tersebut akhirnya didapatkan pola pita DNA yang diuji secara elektroforesis (Lampiran 5, Gambar 1). Faktor komposisi tambahan sangat mempengaruhi pengisolasian DNA yang dilakukan. Nuraini (2004) dalam penelitiannya menyebutkan penyebabnya juga kemungkinan karena proporsi kandungan daging yang lebih sedikit. Penambahan bahan baku seperti tepung atau bahan lain yang banyak mengandung karbohidrat atau polisakarida akan mempengaruhi jumlah konsentrasi dan kemurnian DNA yang dihasilkan.
Teknologi pengolahan pada daging seperti pemanasan menyebabkan kerusakan DNA (DNA terdegradasi) (Erwanto et al., 2009). Martinez dan Yman (1998) dan Saesz et al (2003) melaporkan bahwa proses pemanasan mempengaruhi kualitas DNA karena dengan pemanasan, DNA mengalami degradasi, tetapi menurut Matsunaga et al (1999) DNA dapat diisolasi dari daging yang sudah mengalami pemanasan selama 30 menit pada suhu 100˚C dan 120˚C. Proses pemanasan produk daging olahan biasanya berkisar antara 100˚C dan 120˚C ( untuk perebusan) dan sekitar 150˚C-175˚C (untuk proses penggorengan), sehingga dapat dikatakan pemanasan dalam range tersebut tidak merusak DNA. Menurut Susilo (2002) dalam penelitiannya melakukan pemanasan daging pada suhu 400˚C dan 500˚C dan hasilnya intensitas pita DNA tidak tampak pada gel elektroforesis, hal ini menandakan bahwa pada suhu tersebut DNA telah rusak akibat pemanasan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Matsunaga et al (1999), Kesmen et al (2007), dan Susilo (2002), dapat disimpulkan bahwa DNA dapat diisolasi dari produk olahan daging, tetapi bila pemanasannya dalam waktu yang sangat lama dan terjadi kenaikan suhu menjadi 400˚C dan 500˚C akan terjadi kerusakan DNA ( DNA terdegradasi).
Hasil isolasi template DNA yang didapatkan selanjutnya diamplifikasi dengan menggunakan Real Time PCR. Langkah awal yaitu dengan membuat master mix dari komponen PCR yang dilebihkan sebanyak 10% untuk menghindari terjadinya kekurangan bahan komponennya. Master mix yang dibuat juga harus dipastikan homogen atau tercampur dengan baik agar didapatkan hasil yang konsisten. Komponen – komponen PCR ini terdiri dari template DNA, primer, TaqMan®, TaqMan®probe, dan PCR grade water.
Template yang berupa molekul DNA berperan untuk pembentukan DNA selanjutnya. Sedangkan primer adalah sepasang DNA utas tunggal yang akan membatasi pemanjangan reaksi DNA. Primer dirancang agar bisa menempel pada daerah template DNA yang kita inginkan sehingga harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Larutan TaqMan® mengandung Taq buffer, Taq polymerase, dan dNTP Buffer berfungsi mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Deoxynucleosida triphospate atau dNTP yang terdiri atas dATP, dTTP, dCTP, dGTP merupakan bahan-bahan penyusun DNA baru, Taq polymerase merupakan enzim yang bersifat thermostabil dimana enzim ini tahan terhadap suhu tinggi. Enzi mini disolasi dari bakteri Thermus Autiqus. Dan TaqMan®probe merupakan suatu pelacak berflurosensi yang bisa berpendar sehingga amplifikasi DNA dapat diamati secara real time.
Selanjutnya di dalam mesin Real Time PCR setiap siklus reaksi mengalami tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Denaturasi merupakan tahap pemisahan molekul ganda DNA menjadi rantai tunggal, kemudian tahap annealing merupakan tahap penempelan primer pada template DNA sedangkan yang terakhir adalah tahap pemanjangan rantai DNA.
Setelah semua siklus dilewati akan didapatkan kurva hasil analisa sampel. Kontrol positif yang berasal dari daging babi segar akan menghasilkan kurva berbentuk sigmoid. Kurva ini terbentuk karena primer menempel pada template DNA-nya sehingga terjadi amplifikasi atau perbanyakan DNA yang dapat diamati secara Real Time. Sedangkan kurva yang dihasilkan oleh sampel daging sapi pasar , daging sapi supermarket, daging sapi giling supermarket dan abon sapi membentuk garis lurus seperti garis yang dihasilkan kontrol negatif. Ini berarti primer tidak berikatan dengan template sehingga tidak terjadi amplifikasi atau perbanyakan DNA (Lampiran 6, Gambar 2).
Dari kurva yang dihasilkan sampel tersebut dapat diartikan bahwa kesemua jenis sampel tidak tercemar atau terkontaminasi daging babi karena tidak terdektesinya gen cytocrome b yang dianalisa dengan Real Time PCR.
Dalam melakukan running dengan mesin Real Time ini terdapat beberapa kendala yang mempengaruhi bentuk kurva yang dihasilkan. Pada percobaan pertama kurva yang didapatkan sangat tidak beraturan, ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti kesalahan pemipetan, suhu dan kondisi cahaya ruangan serta kualitas atau kemurnian dari DNA yang diisolasi. Kesalahan pemipetan bisa menyebabkan ketidaksesuaian volume apalagi jika volume yang dibuat sangat kecil. Selain itu penggunaan pipet yang sama untuk berbagai bahan menjadi penyebab utama sumber kontaminasi. Cahaya ruangan juga dapat merusak bahan-bahan yang akan digunakan terutama TaqMan®Probe, sehingga menggangu hasil deteksi. Taqman®Probe mengandung 2 komponen pelacak berflouresensi yaitu Reporter dan Quenser apabila terdapat cahaya, maka reporter akan melepas ikatan pada quenser, dan akan berfluorosensi seketika, sehingga pada saat running real time PCR, TaqMan®probe tidak dapat mendeteksi DNA target dan tidak terjadi flouresensi karena ikatan reporter dan quenser telah lepas, untuk menghindari hal tersebut, maka pada tabung ependorf TaqMan®Probe dilapisi oleh aluminium foil. Begitu juga dengan suhu ruangan yang sangat mempengaruhi kestabilan komponen pereaksi yang sensitif. Untuk mengatasi hal ini maka pengerjaan pencampuran komponen pereaksi dilakukan di dalam ice box.
Pendeteksian menggunakan metode Real Time PCR ini memang harus ekstra teliti dan hati-hati. Namun metode ini memang lebih cepat dibandingkan dengan metode PCR konvensional. Dimana pada PCR konvensional hasil amplifikasi DNA masih harus dideteksi lagi secara elektroforesis, ini berari memakan waktu yang lebih lama dan bahan yang lebih banyak.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
4.1. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa hasil isolasi DNA dari daging yang terdapat di pasar, daging yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket dan abon sapi di kota Padang yang dideteksi dengan metode Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) tidak mengandung gen cytocrome b yang berarti sampel tersebut tidak terkontaminasi oleh daging babi.
4.2. Saran
Disarankan untuk peneliti selanjutnya mencoba metode lain untuk membuktikan kontaminasi daging sapi pada sampel abon.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, A., & Ghasemi, J. 2007. New buffers to improve the quantitative real-time polymerase chain reaction. Bioschi. Biotechnol. Biochem. 71 (8), 1970-1978.
Clop, A., Amills, M., Noguera, J.L., Fernandez, A., Capote, J., Ramon, M.M., Kelly, L., Kijas, J.M.H., Andersson, L., & Sanchez, A. (2004). Easrimating the frequency of Asian cytochrome B haplotypes in standard European and local Spanish pig breeds. Genet. Sel. Evol, 36, 97-104.
Fatchiyah., 2006. Polymerase Chain Reaction : Dasar Teknik Amplifikasi DNA dan Aplikasinya. Diakses 5 November 2010 dari http ://www.worldofteaching.com.
Hikmal, Ali., 2009. Studi Tentang Validitas Label Halal Pada Produk Sosis Yang Beredar di Malang. Diakses 1 November 2010 dari http:// Department of Animal Industrial Technology - student-research.umm.ac.id.
Jamsari. 2010. Bioteknologi pemula: Prinsip dasar dan aplikasi analisis molekuler. Riau: Universitas Riau.
Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. 2007. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages, Diakses 20 Mei 2011 dari http://www.pdfsearch.pro.com
Majelis Ulama Indonesia. 2008. Indonesia Halal Product Directory 2008-2009. Jakarta: Tribuwana Cahya Ananta.
Martinez and M.L. Yman. 1998. Spesies Identification in meat product by RADP analysis.Food reaseach Internasional.31.459-466.333. Dalam : Erwanto, Y., Abidin, M., Rohman, A., dan Sismindari. (2009). Pig spesies identification in Meatballs using Polymerase Chain Reaction Restriction Fragmen Length Polymorfisme. Journal. Universitas Gajah mada. Yogyakarta.
Matsunaga, T., Chikuni, K., Tanabe, R., Muroya, S., Shibata, K., Yamada, J., et al. (1999). A quick and simple method for identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Science, 51, 143-148.
Mergawati, T., Ridwan, M. 2010. Pengujian Pencemaran Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR: Pencarian Sistem Pengujian Efektif, Diakses 30 April 2011 dari http://isjd.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/101109398.pdf
Nuraini. 2004. Pengembangan Sekuen Porcine Repetitive Element-1 (PRE-1) Sebagai Penanda Molekuler Untuk Mendeteksi Material Babi Pada Produk Daging Olahan. (Disertasi). Bogor : IPB
Powledge, T. M., 2003. The Polymerase Chain Reaction. Diakses 10 November 2010 dari http//www.fase./opa/blood supply/ PCR.html. .
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius.
Susilo, A. 2002. Karakteristik Fisik, ultrastruktur dan komposisi kimia daging beberapa bangsa babi. Tesis. Program Pasca Sarjana Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Dalam : Hapsari., Astri, Misrianti., Restu (25 Mei 2007). Gen Sitokrom B sebagai Penanda Molekuler untuk Mendeteksi Cemaran Daging Tikus pada Bakso. Artikel. Institut Pertanian Bogor.
Tanabe, S., Hase, M., Yano, T., Sato, M., Fujimura, T., & Akiyama, H. (2007). A real-time qunatitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in foods. Bioschi. Biotechnol. Biochem, 71 (12), 3131-3135.
Vailleux, C., 2003. “PCR Technology”, Diakses 10 November 2010 dari http//www.accesexcellence.org/LC/SS/PS/PCR/.PCR.technology.html.
Valasek, M.A., & Joyce, J.R. The power of real-time PCR. Advan. Physiol. Edu. 29: 151-159, 2005.
Yuwono, Tribowo. 2005. Biologi Molekular. Jakarta. Penerbit : Erlangga.
Lampiran 1: Skema Isolasi Template DNA dari Daging Sapi (dengan kit roche®)
• Ditimbang 20 mg sampel makanan ditambahkan 100µl PBS dihaluskan
• Ditambahkan 200µl Tissue lysis Buffer dan vortex
• Ditambahkan 40µl Proteinase K dan vortex
• Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 70˚C
• Ditambahkan 40µL larutan protein kinaese
• Diinkubasi selama 2 jam pada suhu 55˚C
• Ditambahkan 200µL larutan binding buffer, diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70˚C
• Ditambahkan 100µL isopropanol
• Disentrifus 8000xg selama 2 menit
• Dipindahkan ke dalam filter tube
• Disentrifus 13000xg selama 4 menit
• Ditambahkan Inhibitor removal buffer 500µl
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
• Ditambahkan Wash buffer 500µl
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
• Ditambahkan 500µl Wash Buffer
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
• Ditambahkan 200µl elution buffer ( dipanaskan 10 menit pada suhu 70˚C)
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
Lampiran 2: Skema Isolasi DNA dengan kit isolasi Promega®
• Ditimbang 20 mg dan gerus dengan penambahan PBS
• Ditambahkan 600µL larutan nuklei lysis dan vortex
• Ditambahkan 1.5 µL larutan proteinase K dan vortex
• Diinkubasi pada suhu 70˚C selama 24 jam
• Ditambahkan 3µL RNAase, homogenkan
• Diinkubasi pada suhu 37˚C selama 30 menit
• Ditambahkan 200µL larutan protein presipitasi, homogenkan
• Disentrifus 13000 xg selama 10 menit pada suhu 4˚C
• Ditambahkan 600 µL isopropanol dingin, homogenkan
• Disentrifus 13000xg selama 4 menit pada suhu 4˚C
• Ditambahkan 600µL etanol dingin dan homogenkan
• Disentrifus 13000xg selama 1 menit pada suhu 4˚C
• Ditambahkan 100µL DNA rehidration, homogenkan
Lampiran 3: Pengecekan Kemurnian DNA Hasil Isolasi Dengan Metode Elektroforesa
• Dicampurkan dengan TE buffer dan blue dye solution, lalu dimasukan ke dalam sumur-sumur gel agarose
• Dimasukan ke dalam larutan etidium bromida 0.5 µl/ml selama 15 menit
• Dimasukan ke dalam aqua dest selama 1 menit
• Diamati gambar dengan alat pengamat DNA (sinar UV)
• Difoto dengan film polaroid
Lampiran 4 : Deteksi cytocrome b menggunakan Metode Real Time PCR
• dimasukkan ke dalam mesin Real-Time PCR
Lampiran 5 : Foto Gel Agarose Hasil Elektroforesis DNA (Pemeriksaan Hasil Kualitatif DNA hasil isolasi)
Gambar 1 : Foto gel agarose elektroforesis DNA dari daging babi, sampel daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket dan abon sapi.
Lampiran 6 : Kurva Hasil Dteksi Gen Cytocrome b pada abon sapi
Gambar 2 : Kurva Hasil Deteksi Gen cytochrome b pada abon sapi
Keterangan :
Warna biru : Daging babi (kontrol positif)
Warna hijau : Aquadest steril (kontrol negatif)
Warna merah : Sampel abon sapi
Warna hitam : Daging sapi supermarket
Warna merah jambu : Daging sapi giling supermarket
Warna hijau tua : Daging sapi pasar
Lampiran 7 : Foto High Pure Template Kit (Roche®) ( reagen isolasi DNA)
Gambar 3 : Kit isolasi DNA (Roche®)
Lampiran 8 : Sampel daging sapi dan olahannya yang beredar di kota padang dan kontrol positif (daging babi)
Gambar 4 : Daging babi, daging giling supermarket, abon sapi, daging sapi supermarket dan daging pasar.
Lampiran 9 : Foto Alat Real Time PCR
Gambar 5 : Alat Real Time PCR.
Gambar 6 : Monitor Yang dihubungkan ke Alat Real Time PCR.
Lampiran 11 : Foto peralatan yang digunakan dalam penelitian
Gambar 7 : Filter tube dan Collection tube
Gambar 8 : Pipet mikro ( 200µL, 10µL,1000µL)
Gambar 9 : Tabung ependorf
Gambar 10 : Alat Inkubator
Gambar 11 : Ice Box
Nama : ENNISA SONIA
No. BP : 07131026
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Pemberian label halal pada makanan sangat penting untuk menjamin keamanan produk makanan dan menjaga kepercayaan konsumen (Tanabe, et al., 2007). Itulah sebabnya produk-produk bersertifikasi halal sangat didambakan dan dicari oleh konsumen pada umumnya, baik muslim maupun non-muslim (Majelis Ulama Indonesia, 2008).
Produk pangan yang tercemar oleh daging babi cukup meresahkan masyarakat di Indonesia. BPOM menemukan produk olahan dari daging sapi yang tercemar oleh daging babi seperti sosis, kornet, bakso, dan lain-lain. Seluruh makanan yang ditemukan ternyata bukan asli buatan Indonesia tetapi diimpor dari Malaysia, Singapura, Thailand, dan Jerman. Beberapa diantaranya tidak mencantumkan komposisi makanan dengan lengkap (Hikmal, 2009).
DNA mitokondria biasanya digunakan untuk menunjukkan perbedaan filogenik dari berbagai spesies. Pada babi, sitokrom-b dan bagian D-loop digunakan sebagai penanda genetik adanya hubungan antara keturunan babi yang berbeda. Mitokondria babi (mtDNA) merupakan 16 kb sirkular molekul dimana di dalamnya terdapat 13 protein-kode gen, 22 tRNA dan gen bertanggung jawab untuk 12S dan 16S rRNA. Sitokrom-B haplotipe dapat dengan mudah dideteksi dengan dasar empat nukleotida polimorphisme yang terletak di posisi 15036, 15038, 15041, dan 15045 bp pada rantai DNA lengkap dari mtDNA babi (Clop, et al., 2004).
Kemajuan dalam teknologi DNA telah membawa pada perkembangan yang cepat dalam pendekatan alternatif untuk identifikasi spesies. Penggunaan PCR dalam teknik analisis makanan telah meningkat karena metodenya yang lebih sederhana, spesifik dan sensitif. Polymerase Chain Reaction (PCR) ditemukan oleh Karry Mulis pada tahun 1980. PCR adalah suatu metode yang dapat melipatgandakan segmen DNA dalam tabung dengan bantuan enzim DNA polymerase. Prinsip kerja metode PCR yaitu mengubah rantai ganda DNA menjadi helaian tunggal, terbentuknya ikatan anatara primer dan terjadi pemanjangan DNA dengan bantuan enzim Taq Polymerase (Matsunaga, et al., 1999; Valasek & Joyce, 2005; Powledge, 2003; Vailleux, 2003).
Metode PCR kemudian mengalami pengembangan yang dinamakan Real-Time PCR, bahwa hasil amplifikasi dianalisis selama proses amplifikasi dengan menggunakan pewarna DNA atau pelacak berfluorosensi. Analisis data dilakukan dalam instrumen yang sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel, dan tanpa pemisahan dengan elektroforesis (Sudjadi, 2008). Real-Time PCR ini lebih tepat dalam pengukuran secara kuantitatif jumlah dari asam nukleat dibandingkan dengan PCR konvensional, karena pada Real-Time PCR amplifikasi asam nukleat terdeteksi pada fase eksponensial dimana lebih baik dibandingkan fase plateau pada PCR konvensional (Ahmad, et al., 2007).
Untuk itu metoda yang akan digunakan dalam penelitian ini dipilih metoda Real-Time Polymerase Chain Reaction. Kepekaan dari metoda ini ditentukan oleh pemilihan primer yang tepat. Dalam penelitian ini dipilih gen Sitokrom-B sebagai gen spesifik dari babi yang merupakan target utama untuk mendeteksi kandungan babi di dalam produk daging (Tanabe et al., 2007). Pada penelitian ini sendiri akan dilakukan deteksi pada beberapa sampel yang dicurigai mengandung unsur babi.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah ditemukan gen sitokrom-b babi pada daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket, dan abon sapi di kota Padang?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mendeteksi gen sitokrom-b babi pada daging sapi dan produk olahannya yang terdapat dipasaran
2. Memanfaatkan metoda Real-Time PCR
1.4 Manfaat Penelitian
1. Aplikasi molekular dengan Real-Time PCR
2. Mengetahui kehalalan produk makanan
3. PELAKSANAAN PENELITIAN
2.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan selama dua bulan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Andalas.
2.2 Metode Penelitian
2.2.1. Penyiapan alat dan bahan
2.2.2. Strilisasi Alat
2.2.3. Pengambilan Sampel
2.2.3. Isolasi DNA dari sampel
2.2.4. Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian DNA hasil isolasi dengan metode Elektroforesa
2.2.5. Deteksi Cytocrome b dengan metoda Real Time PCR
2.3 Alat dan Bahan
2.3.1 Alat
Mesin Real-Time PCR (LightCycler®), tabung eppendorf 1.5 ml, erlemeyer, gelas piala, gelas ukur, pipet mikro (eppendorf®), tip (10 µl, 200µl, 100µl), vortex (Mixer® VM-100), timbangan digital, sentrifugator (Thermo®), laminar air flow (ESCO®), autoklaf, inkubator (Thermo®), High Pure Filter tubes (Roche®), collection tubes (Roche®), lumpang, stamfer, perangkat elektroforesa, gel documentation system (Bio-Rad®), kertas parafilm.
2.3.2 Bahan
Sampel abon sapi, daging sapi pasar, daging sapi supermarket, bakso, kontrol positif (daging babi), kontrol negatif (aqua), daging sapi segar, High pure PCR Template Preparation Kit (Rosce®) (yang terdiri dari Tissue Llysis buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, wash buffer, elution buffer), LightCycler Master mix kit PCR (Roche®), PBS (Phospat Buffer saline ), agarose powder, ethidium bromida, Tris Boric acid EDTA (TBE),Isopropanol.
2.4 Cara Kerja
2.4.1 Sterilisasi Alat Dan Bahan
Alat-alat gelas dibungkus dengan kertas perkamen, pipet mikro ditaruh dalam wadahnya, ditutup rapat dan diberi selotip, eppendorf dimasukkam dalam gelas piala ditutup rapat dengan aluminium foil, lalu semua disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 15 lbs selama 15 menit.
2.4.2 Pengambilan Sampel
Sampel berupa daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket , dan abon sapi yang berdar di kota di kota Padang.
2.4.3 Isolasi DNA sampel
1. 20 mg sampel digiling dan tambahkan 100µl PBS (Phospat Buffer Saline) kemudian pindahkan ke dalam tabung ependorf.
2. Tambahkan 200µl Tissue lysis buffer kemudian homogenkan menggunakan vortex.
3. Tambahkan 40µl Proteinase K kemudian homogenkan menggunakan vortex.
4. Inkubasi sampel selama 24 jam pada suhu 70˚C.
5. Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 200µl Binding Buffer kemudian homogenkan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 70˚C.
6. Tambahkan 100µl isopropanol dingin kemudian sentrifus 8000xg selama 2 menit dan akan terpisah antara endapan dan supernatan.
7. Supernatan dipindahkan kedalam filter tube dimana di bagian bawah filter tube diletakan collection tube dan sentrifus 13000 xg selama 4 menit, dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
8. Endapan yang terdapat pada filter tube ditambahkan Inhibitor removal buffer 500µl, dan ganti colection tube sebelumnya dengan collection tube yang baru kemudian sentrifus 13000xg selama 2 menit, dimana endapan akan berada pada filter tube dan supernatan akan berada pada collection tube.
9. Ganti collection tube sebelumnya dengan collection tube yang baru dan pada filter tube ditambahkan Wash Buffer 500µl dan sentrifus 13000xg selama 2 menit, maka akan terpisah antara endapan dan supernatan, dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
10. Ganti collection tube sebelumnya dengan collection tube yang baru dan pada filter tube ditambahkan Wash Buffer 500µl dan sentrifus 13000xg selama 2 menit, maka akan terpisah antara endapan dan supernatan, dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
11. Ganti collection tube sebelumnya dengan tabung ependorf 1.5 ml dan pada filter tube ditambahkan ellution buffer 200µl yang telah diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70˚C kemudian sentrifus 13000xg selama 2 menit maka akan terpisah antara supernatan dan endapan dimana endapan terdapat pada filter tube dan supernatan terdapat pada collection tube.
12. Supernatan yang terdapat pada tabung ependorf merupakan template DNA hasil isolasi.
2.4.4 Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian DNA hasil isolasi dengan metode Elektroforesa
Pembuatan Agarose 2% dengan cara 2 gram serbuk agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE di dalam erlemeyer, dipanaskan hingga terbentuk massa yang homogen, didihkan 1-2 menit, lalu dituangkan pada cetakan elektroforesa. 5µl Template DNA hasil isolasi dicampurkan dengan 1µl blue dye solution dan 5µl TE buffer diatas kertas parafilm, lau dimasukan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesa dilakukan menggunakan gel agarose 2 % dan menggunakan tegangan 75 volt selama 1 jam. Selanjutnya gel diwarnai dengan larutan ethidium bromida selama 15 menit, kemudian direndan dengan air selama 5 menit dan dilihat gambarnya dibawah alat pengamat DNA ( lampu UV). Gel tersebut difoto menggunakan Gel Documentation System. Pada foto dapat dilihat pemisahan pita DNA hasil isolasi.
2.4.4 Pengaturan Program Real Time PCR
Komponen-komponen dan campuran yang digunakan :
Pereaksi Jumlah Pereaksi (µl)
Aquadest Steril 8
Forward Primer 1,0
Reverse Primer 1,0
Probe 1,0
Taqman 4
Template DNA 5
Volume Total 20
Keterangan :
Forward Primer : 5’-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3’
Reverse Primer : 5’-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3’
Tiap-tiap komponen dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian ditambahkan genom DNA, dihomogenkan dan dimasukkan ke mesin Real-Time PCR yang telah dibuat program kerjanya.
Program mesin Real-Time PCR untuk gen sitokrom-b babi (45 siklus) :
Siklus Temperatur (°C) Waktu
1 95 10 menit
45 95
58
72 10 menit
40 menit
60 detik
1 40 7 menit
1 10 ∞
2.4.5 Analisi Data
Data berupa grafik hasil deteksi dengan metode Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) yang siap untuk dianalisis.
2.6 Jadwal Pelaksanaan
No
Kegiatan Bulan ke
1 2 3 4 5 6 7
1 Persiapan / Pelaksanaan Penelitian
2 Pengolahan data
3 Penulisan Skripsi/makalah seminar
4 Persiapan Seminar Hasil
5 Penyempurnaan Skripsi dan Persiapan Ujian Akhir
6 Ujian Akhir
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Hasil
Dari penelitian yang telah dilaksanakan diperoleh hasil sebagai berikut :
1. Didapatkan template DNA hasil isolasi dari sampel daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, dan daging sapi giling yang terdapat di supermarket dengan menggunakan metode elektroforesis. (Lampiran 5, Gambar 1).
2. Hasil deteksi gen sitokrom b babi pada semua template DNA sampel yang dianalisa dengan Real Time PCR menunjukkan hasil yang negatif. Ini dapat dilihat dari grafik yang dihasilkan, dimana grafik yang muncul hanya mendatar tidak berhimpitan dengan garis pada grafik kontrol positif dari daging babi segar. (Lampiran 6, Gambar 2).
3.2. Pembahasan
Identifikasi spesies jaringan dalam produk daging atau makanan olahan dapat dilakukan dalam berbagai metode. Beberapa metode yang sering dilakukan antara lain dengan metode elektroforesis, kromatografi dan teknik imunologi. Namun metode ini sering tidak cocok untuk produk makanan yang kompleks atau rumit, tidak sensitif untuk bahan-bahan yang telah diproses karena sulit untuk membedakan spesies yang berhubungan dan memakan waktu yang lama. (Kesmen, 2007).
Kemajuan dalam bidang teknologi membawa kita pada pengujian dengan metode yang lebih baik dan efektif untuk mendeteksi cemaran atau kontaminasi suatu campuran yang tidak diinginkan dalam suatu makanan olahan. Mergawati & Ridwan (2010) dalam penelitiannya menyebutkan bahwa biasanya pencampuran dengan bahan lain selain bahan aslinya dimaksudkan untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif lebih murah dibandingkan jika makanan olahan tersebut dibuat dari daging sapi murni. Salah satunya metode pendeteksian yang dilakukan yaitu dengan menggunakan metode yang efektif dan efisien yakni Real Time Polymerase Chain Reaction.
Real Time PCR merupakan pengembangan dari metode PCR, bahwa hasil amplifikasi dianalisis selama proses amplifikasi denagn menggunakan pewarna DNA atau pelacak berflurosensi. Analisi data dilakukan dalam instrument yang sama, tanpa pemindahan sampel, dan tanpa pemisahan dengan elektroforesis. Metode ini dapat digunakan untuk analisis secara kuantitatif jumlah DNA awal sehingga dapat digunakan untuk analisis pengukuran secara kuantitatif (Sudjadi, 2008).
Langkah pertama dalam pengerjaan penelitian ini adalah dengan melakukan isolasi DNA untuk mendapatkan template DNA. Dimana DNA hasil isolasi tersebut setelah itu diuji kemurniannya dengan metode elektroforesis dan kemudian akan dianalisa menggunakan Real Time PCR.
Isolasi DNA ini adalah upaya untuk membebaskan materi genetik (DNA) dari dinding sel dan ikatan protein dengan mengupayakan tingkat kerusakan baik mekanis maupun fisis seminimal mungkin terhadap materi genetik tersebut (Jamsari, 2010).
Isolasi DNA pertama kali dilakukan pada sampel daging babi segar. Template DNA yang didapat dari daging babi segar ini dijadikan sebagai kontrol positif. Metode isolasi DNA menggunakan produk commercial kit yaitu High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche®). Reagen High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche®) terdiri dari larutan Tissue Lysis Buffer, larutan Binding Buffer, Proteinase K, Larutan Inhibitor Removal Buffer, Larutan Wash Buffer, Larutan Elution Buffer (Lampiran 7, Gambar 3).
Larutan Tissue Lysis Buffer berfungsi dalam pemecahan jaringan secara mekanik untuk membebaskan sel-sel yang terdapat pada sampel. Larutan Binding Buffer berfungsi mempertahankan ph. Penambahan Proteinase K bertujuan mendegradasi protein-protein yang mengikat benang-benang DNA pada kromosom dan menginaktivasi enzim DNAse. Larutan Inhibitor Removal Buffer dan Larutan Wash Buffer berfungsi untuk pemurnian DNA, sedangkan larutan Elution Buffer bertujuan untuk melarutkan endapan DNA yang terdapat pada filter tube sehingga didapatkan template DNA hasil isolasi.
Kemudian selanjutnya dilakukan elektroforesis terhadap template DNA yang telah didapatkan tersebut. Teknik elektroforesis merupakan salah satu teknik pemisahan molekul dengan menggunakan arus listrik yang memanfaatkan prinsip perbedaan berat/besar molekul. Gel elektroforesis mempunyai pori-pori sehingga DNA mudah menyerap melewati lubang pori-pori dan selanjutnya berpindah ke muatan positif. Konsentrasi gel agarose akan menentukan besarnya pori-pori yang akan dilewati oleh molekul DNA. Semakin besar konsentrasi agarosa yang digunakan, berarti semakin kecil pori-pori yang akan dilalui, sehingga laju migrasi molekul DNA juga semakin lambat. Selain konsentrasi gel agarosa, beberapa fakor lain yang juga mempengaruhi hasil elektroforesa, yaitu jumlah molekul DNA, berat molekul dan kekuatan arus listrik yang digunakan (Jamsari, 2007).
Pembuatan Agarose 2% dengan cara 2 gram serbuk agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE di dalam erlemeyer, dipanaskan hingga terbentuk massa yang homogen, didihkan 1-2 menit, lalu dituangkan pada cetakan elektroforesa. 4µl Template DNA hasil isolasi dicampurkan dengan 1µl blue dye solution dan 6µlTE buffer diatas kertas parafilm, lau dimasukan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesa dilakukan menggunakan gel agarose 2 % dan menggunakan tegangan 75 volt selama 1 jam. Selanjutnya gel diwarnai dengan larutan ethidium bromida selama 15 menit, kemudian direndan dengan air selama 5 menit dan dilihat gambar dibawah alat pengamat DNA ( lampu UV). Gel tersebut difoto menggunakan Gel Documentation System. Pada foto dapat dilihat pemisahan pita DNA hasil isolasi.
Hasil isolasi DNA dan pengujian kemurniannya dengan elektroforesis pada daging babi segar memperlihatkan pola pita DNA, ini berarti template DNA yang didapatkan telah murni. Template DNA dari daging babi segar ini dijadikan sebagai kontrol positif. Sedangkan hasil elektroforesa pada sampel abon untuk pengujian pertama kalinya tidak didapati adanya penampakan pola pita DNA. Hal ini dapat terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain karena sampel abon sapi ini telah banyak bercampur dengan bahan lainnya serta juga bisa dikarenkan kandungan dagingnya yang sedikit. Selain itu zat warna yang terdapat pada sampel juga sangat mempengaruhi isolasi DNA-nya.
Pada percobaan yang kedua, dilakukan perendaman terlebih dahulu terhadap sampel abon sapi tersebut dengan tujuan mengurangi konsentrasi zat warna didalamnya. Kemudian setelah dilakukan elektroforesis kembali, hasil yang diperoleh hanya berupa smear yang artinya template DNA yang didapat masih belum murni.
Kemudian dilakukan kembali pengisolasian terhadap sampel, kali ini digunakan kit komersial lainnya yakni kit Promega. Perbedaan kit promega ini dengan kit Rosche yang telah dilakukan terlebih dahulu yaitu pada prinsip kerjanya. Dimana kerja kit rosche menggunakan prinsip penyaringan atau filter sehingga ada kemungkinan DNA tersangkut pada filternya. Sedangkan kit promega menggunakan prinsip pengendapan, dimana dengan kecepatan sentrifus yang besar DNA akan mengendap dibawah tabung eppendorf.
Namun isolasi yang dilakukan dengan kit promega ini masih memberikan pola pita DNA berupa smear. Hal ini menandakan DNA yang didapatkan masih belum murni. Oleh karena itu dilakukan perbandingan dengan menguji sampel lain berupa daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket dan daging sapi giling yang terdapat di supermarket. Dalam pengerjaan isolasi dari ketiga sampel baru tersebut akhirnya didapatkan pola pita DNA yang diuji secara elektroforesis (Lampiran 5, Gambar 1). Faktor komposisi tambahan sangat mempengaruhi pengisolasian DNA yang dilakukan. Nuraini (2004) dalam penelitiannya menyebutkan penyebabnya juga kemungkinan karena proporsi kandungan daging yang lebih sedikit. Penambahan bahan baku seperti tepung atau bahan lain yang banyak mengandung karbohidrat atau polisakarida akan mempengaruhi jumlah konsentrasi dan kemurnian DNA yang dihasilkan.
Teknologi pengolahan pada daging seperti pemanasan menyebabkan kerusakan DNA (DNA terdegradasi) (Erwanto et al., 2009). Martinez dan Yman (1998) dan Saesz et al (2003) melaporkan bahwa proses pemanasan mempengaruhi kualitas DNA karena dengan pemanasan, DNA mengalami degradasi, tetapi menurut Matsunaga et al (1999) DNA dapat diisolasi dari daging yang sudah mengalami pemanasan selama 30 menit pada suhu 100˚C dan 120˚C. Proses pemanasan produk daging olahan biasanya berkisar antara 100˚C dan 120˚C ( untuk perebusan) dan sekitar 150˚C-175˚C (untuk proses penggorengan), sehingga dapat dikatakan pemanasan dalam range tersebut tidak merusak DNA. Menurut Susilo (2002) dalam penelitiannya melakukan pemanasan daging pada suhu 400˚C dan 500˚C dan hasilnya intensitas pita DNA tidak tampak pada gel elektroforesis, hal ini menandakan bahwa pada suhu tersebut DNA telah rusak akibat pemanasan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Matsunaga et al (1999), Kesmen et al (2007), dan Susilo (2002), dapat disimpulkan bahwa DNA dapat diisolasi dari produk olahan daging, tetapi bila pemanasannya dalam waktu yang sangat lama dan terjadi kenaikan suhu menjadi 400˚C dan 500˚C akan terjadi kerusakan DNA ( DNA terdegradasi).
Hasil isolasi template DNA yang didapatkan selanjutnya diamplifikasi dengan menggunakan Real Time PCR. Langkah awal yaitu dengan membuat master mix dari komponen PCR yang dilebihkan sebanyak 10% untuk menghindari terjadinya kekurangan bahan komponennya. Master mix yang dibuat juga harus dipastikan homogen atau tercampur dengan baik agar didapatkan hasil yang konsisten. Komponen – komponen PCR ini terdiri dari template DNA, primer, TaqMan®, TaqMan®probe, dan PCR grade water.
Template yang berupa molekul DNA berperan untuk pembentukan DNA selanjutnya. Sedangkan primer adalah sepasang DNA utas tunggal yang akan membatasi pemanjangan reaksi DNA. Primer dirancang agar bisa menempel pada daerah template DNA yang kita inginkan sehingga harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Larutan TaqMan® mengandung Taq buffer, Taq polymerase, dan dNTP Buffer berfungsi mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Deoxynucleosida triphospate atau dNTP yang terdiri atas dATP, dTTP, dCTP, dGTP merupakan bahan-bahan penyusun DNA baru, Taq polymerase merupakan enzim yang bersifat thermostabil dimana enzim ini tahan terhadap suhu tinggi. Enzi mini disolasi dari bakteri Thermus Autiqus. Dan TaqMan®probe merupakan suatu pelacak berflurosensi yang bisa berpendar sehingga amplifikasi DNA dapat diamati secara real time.
Selanjutnya di dalam mesin Real Time PCR setiap siklus reaksi mengalami tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi. Denaturasi merupakan tahap pemisahan molekul ganda DNA menjadi rantai tunggal, kemudian tahap annealing merupakan tahap penempelan primer pada template DNA sedangkan yang terakhir adalah tahap pemanjangan rantai DNA.
Setelah semua siklus dilewati akan didapatkan kurva hasil analisa sampel. Kontrol positif yang berasal dari daging babi segar akan menghasilkan kurva berbentuk sigmoid. Kurva ini terbentuk karena primer menempel pada template DNA-nya sehingga terjadi amplifikasi atau perbanyakan DNA yang dapat diamati secara Real Time. Sedangkan kurva yang dihasilkan oleh sampel daging sapi pasar , daging sapi supermarket, daging sapi giling supermarket dan abon sapi membentuk garis lurus seperti garis yang dihasilkan kontrol negatif. Ini berarti primer tidak berikatan dengan template sehingga tidak terjadi amplifikasi atau perbanyakan DNA (Lampiran 6, Gambar 2).
Dari kurva yang dihasilkan sampel tersebut dapat diartikan bahwa kesemua jenis sampel tidak tercemar atau terkontaminasi daging babi karena tidak terdektesinya gen cytocrome b yang dianalisa dengan Real Time PCR.
Dalam melakukan running dengan mesin Real Time ini terdapat beberapa kendala yang mempengaruhi bentuk kurva yang dihasilkan. Pada percobaan pertama kurva yang didapatkan sangat tidak beraturan, ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti kesalahan pemipetan, suhu dan kondisi cahaya ruangan serta kualitas atau kemurnian dari DNA yang diisolasi. Kesalahan pemipetan bisa menyebabkan ketidaksesuaian volume apalagi jika volume yang dibuat sangat kecil. Selain itu penggunaan pipet yang sama untuk berbagai bahan menjadi penyebab utama sumber kontaminasi. Cahaya ruangan juga dapat merusak bahan-bahan yang akan digunakan terutama TaqMan®Probe, sehingga menggangu hasil deteksi. Taqman®Probe mengandung 2 komponen pelacak berflouresensi yaitu Reporter dan Quenser apabila terdapat cahaya, maka reporter akan melepas ikatan pada quenser, dan akan berfluorosensi seketika, sehingga pada saat running real time PCR, TaqMan®probe tidak dapat mendeteksi DNA target dan tidak terjadi flouresensi karena ikatan reporter dan quenser telah lepas, untuk menghindari hal tersebut, maka pada tabung ependorf TaqMan®Probe dilapisi oleh aluminium foil. Begitu juga dengan suhu ruangan yang sangat mempengaruhi kestabilan komponen pereaksi yang sensitif. Untuk mengatasi hal ini maka pengerjaan pencampuran komponen pereaksi dilakukan di dalam ice box.
Pendeteksian menggunakan metode Real Time PCR ini memang harus ekstra teliti dan hati-hati. Namun metode ini memang lebih cepat dibandingkan dengan metode PCR konvensional. Dimana pada PCR konvensional hasil amplifikasi DNA masih harus dideteksi lagi secara elektroforesis, ini berari memakan waktu yang lebih lama dan bahan yang lebih banyak.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
4.1. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa hasil isolasi DNA dari daging yang terdapat di pasar, daging yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket dan abon sapi di kota Padang yang dideteksi dengan metode Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) tidak mengandung gen cytocrome b yang berarti sampel tersebut tidak terkontaminasi oleh daging babi.
4.2. Saran
Disarankan untuk peneliti selanjutnya mencoba metode lain untuk membuktikan kontaminasi daging sapi pada sampel abon.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, A., & Ghasemi, J. 2007. New buffers to improve the quantitative real-time polymerase chain reaction. Bioschi. Biotechnol. Biochem. 71 (8), 1970-1978.
Clop, A., Amills, M., Noguera, J.L., Fernandez, A., Capote, J., Ramon, M.M., Kelly, L., Kijas, J.M.H., Andersson, L., & Sanchez, A. (2004). Easrimating the frequency of Asian cytochrome B haplotypes in standard European and local Spanish pig breeds. Genet. Sel. Evol, 36, 97-104.
Fatchiyah., 2006. Polymerase Chain Reaction : Dasar Teknik Amplifikasi DNA dan Aplikasinya. Diakses 5 November 2010 dari http ://www.worldofteaching.com.
Hikmal, Ali., 2009. Studi Tentang Validitas Label Halal Pada Produk Sosis Yang Beredar di Malang. Diakses 1 November 2010 dari http:// Department of Animal Industrial Technology - student-research.umm.ac.id.
Jamsari. 2010. Bioteknologi pemula: Prinsip dasar dan aplikasi analisis molekuler. Riau: Universitas Riau.
Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. 2007. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages, Diakses 20 Mei 2011 dari http://www.pdfsearch.pro.com
Majelis Ulama Indonesia. 2008. Indonesia Halal Product Directory 2008-2009. Jakarta: Tribuwana Cahya Ananta.
Martinez and M.L. Yman. 1998. Spesies Identification in meat product by RADP analysis.Food reaseach Internasional.31.459-466.333. Dalam : Erwanto, Y., Abidin, M., Rohman, A., dan Sismindari. (2009). Pig spesies identification in Meatballs using Polymerase Chain Reaction Restriction Fragmen Length Polymorfisme. Journal. Universitas Gajah mada. Yogyakarta.
Matsunaga, T., Chikuni, K., Tanabe, R., Muroya, S., Shibata, K., Yamada, J., et al. (1999). A quick and simple method for identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Science, 51, 143-148.
Mergawati, T., Ridwan, M. 2010. Pengujian Pencemaran Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR: Pencarian Sistem Pengujian Efektif, Diakses 30 April 2011 dari http://isjd.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/101109398.pdf
Nuraini. 2004. Pengembangan Sekuen Porcine Repetitive Element-1 (PRE-1) Sebagai Penanda Molekuler Untuk Mendeteksi Material Babi Pada Produk Daging Olahan. (Disertasi). Bogor : IPB
Powledge, T. M., 2003. The Polymerase Chain Reaction. Diakses 10 November 2010 dari http//www.fase./opa/blood supply/ PCR.html. .
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius.
Susilo, A. 2002. Karakteristik Fisik, ultrastruktur dan komposisi kimia daging beberapa bangsa babi. Tesis. Program Pasca Sarjana Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Dalam : Hapsari., Astri, Misrianti., Restu (25 Mei 2007). Gen Sitokrom B sebagai Penanda Molekuler untuk Mendeteksi Cemaran Daging Tikus pada Bakso. Artikel. Institut Pertanian Bogor.
Tanabe, S., Hase, M., Yano, T., Sato, M., Fujimura, T., & Akiyama, H. (2007). A real-time qunatitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in foods. Bioschi. Biotechnol. Biochem, 71 (12), 3131-3135.
Vailleux, C., 2003. “PCR Technology”, Diakses 10 November 2010 dari http//www.accesexcellence.org/LC/SS/PS/PCR/.PCR.technology.html.
Valasek, M.A., & Joyce, J.R. The power of real-time PCR. Advan. Physiol. Edu. 29: 151-159, 2005.
Yuwono, Tribowo. 2005. Biologi Molekular. Jakarta. Penerbit : Erlangga.
Lampiran 1: Skema Isolasi Template DNA dari Daging Sapi (dengan kit roche®)
• Ditimbang 20 mg sampel makanan ditambahkan 100µl PBS dihaluskan
• Ditambahkan 200µl Tissue lysis Buffer dan vortex
• Ditambahkan 40µl Proteinase K dan vortex
• Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 70˚C
• Ditambahkan 40µL larutan protein kinaese
• Diinkubasi selama 2 jam pada suhu 55˚C
• Ditambahkan 200µL larutan binding buffer, diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70˚C
• Ditambahkan 100µL isopropanol
• Disentrifus 8000xg selama 2 menit
• Dipindahkan ke dalam filter tube
• Disentrifus 13000xg selama 4 menit
• Ditambahkan Inhibitor removal buffer 500µl
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
• Ditambahkan Wash buffer 500µl
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
• Ditambahkan 500µl Wash Buffer
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
• Ditambahkan 200µl elution buffer ( dipanaskan 10 menit pada suhu 70˚C)
• Disentrifus 13000xg selama 2 menit
Lampiran 2: Skema Isolasi DNA dengan kit isolasi Promega®
• Ditimbang 20 mg dan gerus dengan penambahan PBS
• Ditambahkan 600µL larutan nuklei lysis dan vortex
• Ditambahkan 1.5 µL larutan proteinase K dan vortex
• Diinkubasi pada suhu 70˚C selama 24 jam
• Ditambahkan 3µL RNAase, homogenkan
• Diinkubasi pada suhu 37˚C selama 30 menit
• Ditambahkan 200µL larutan protein presipitasi, homogenkan
• Disentrifus 13000 xg selama 10 menit pada suhu 4˚C
• Ditambahkan 600 µL isopropanol dingin, homogenkan
• Disentrifus 13000xg selama 4 menit pada suhu 4˚C
• Ditambahkan 600µL etanol dingin dan homogenkan
• Disentrifus 13000xg selama 1 menit pada suhu 4˚C
• Ditambahkan 100µL DNA rehidration, homogenkan
Lampiran 3: Pengecekan Kemurnian DNA Hasil Isolasi Dengan Metode Elektroforesa
• Dicampurkan dengan TE buffer dan blue dye solution, lalu dimasukan ke dalam sumur-sumur gel agarose
• Dimasukan ke dalam larutan etidium bromida 0.5 µl/ml selama 15 menit
• Dimasukan ke dalam aqua dest selama 1 menit
• Diamati gambar dengan alat pengamat DNA (sinar UV)
• Difoto dengan film polaroid
Lampiran 4 : Deteksi cytocrome b menggunakan Metode Real Time PCR
• dimasukkan ke dalam mesin Real-Time PCR
Lampiran 5 : Foto Gel Agarose Hasil Elektroforesis DNA (Pemeriksaan Hasil Kualitatif DNA hasil isolasi)
Gambar 1 : Foto gel agarose elektroforesis DNA dari daging babi, sampel daging sapi yang terdapat di pasar, daging sapi yang terdapat di supermarket, daging sapi giling yang terdapat di supermarket dan abon sapi.
Lampiran 6 : Kurva Hasil Dteksi Gen Cytocrome b pada abon sapi
Gambar 2 : Kurva Hasil Deteksi Gen cytochrome b pada abon sapi
Keterangan :
Warna biru : Daging babi (kontrol positif)
Warna hijau : Aquadest steril (kontrol negatif)
Warna merah : Sampel abon sapi
Warna hitam : Daging sapi supermarket
Warna merah jambu : Daging sapi giling supermarket
Warna hijau tua : Daging sapi pasar
Lampiran 7 : Foto High Pure Template Kit (Roche®) ( reagen isolasi DNA)
Gambar 3 : Kit isolasi DNA (Roche®)
Lampiran 8 : Sampel daging sapi dan olahannya yang beredar di kota padang dan kontrol positif (daging babi)
Gambar 4 : Daging babi, daging giling supermarket, abon sapi, daging sapi supermarket dan daging pasar.
Lampiran 9 : Foto Alat Real Time PCR
Gambar 5 : Alat Real Time PCR.
Gambar 6 : Monitor Yang dihubungkan ke Alat Real Time PCR.
Lampiran 11 : Foto peralatan yang digunakan dalam penelitian
Gambar 7 : Filter tube dan Collection tube
Gambar 8 : Pipet mikro ( 200µL, 10µL,1000µL)
Gambar 9 : Tabung ependorf
Gambar 10 : Alat Inkubator
Gambar 11 : Ice Box
